جداسازی و شناسایی باکتری های تولیدکنندۀ آنزیم کوتیناز

نویسندگان

دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان

چکیده
آنزیم کوتیناز جزء خانوادۀ آنزیمی سرین هیدرولازها بوده که توانایی هیدرولیز انواع استرها و پلی ­استرهای کوچک مانند کوتین را دارد. کوتین گیاهان از ترکیبات پلی­ استری هیدروکسی و اپوکسی اسید چرب تشکیل شده است که در مقابل آب نفوذناپذیر است و تنها باکتری­ های بیماری­ زای گیاهی قادر به تجزیۀ آن هستند. به­ منظور شناسایی این مقاومت، در ابتدا میوه­ های خیار (Cucumis sativus-' C. sativus')، سیب زرد (Golden Delicious apple 'Malus domestica') ، سیب قرمز (Red Delicious apple 'Malus domestica'') و گوجه فرنگی (Solanum lycopersicum Mill. Commun ' S. lycopersicum') تهیه و از پوست این میوه ­ها به روش کلرفرم متانول، کوتین استخراج و میزان آن در این میوه ­ها مقایسه شد. سپس، با استفاده از محیط کشتی اختصاصی حاوی کوتین و سنجش فعالیت آنزیمی، جداسازی سویه­ های تولیدکنندۀ آنزیم انجام شد. از نمونه­ های غربال شده، DNA استخراج شد و واکنش PCR به­ کمک پرایمرهای یونیورسال براساس 16s DNA جهت شناسایی نمونه­ ها انجام گرفت. در ادامۀ مطالعات بیوانفورماتیک، شناسایی و ثبت نمونه­ ها در ژن بانک انجام شد. نتایج نشان می­داد که درصد کوتین استخراج­شده در سیب بیشتر است و احتمالاً سیب درمقابل آفات و بیماری­ ها مقاوم ­تر است. همچنین، شش سویۀ تولیدکنندۀ آنزیم کوتیناز از جنس Klebsiella و Enterobacter به­ کمک بررسی فعالیت آنزیمی و محیط کشت اختصاصی حاوی کوتین جداسازی و توالی کدکنندۀ ناحیۀ 16s DNA این باکتری­ ها در ژن بانک ثبت شد

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله English

Isolation and identification of cutinase enzyme producing bacteria

نویسندگان English

Nasrin Parvaresh
Mojtaba Mortazavi
Masoud Torkzadeh-Mahani
Graduate University of Advanced Technology, Kerman
چکیده English

Cutinase belongs to the family of serine hydrolases which are capable of hydrolysis of esters and small polyester such as cutin. The cutin of plants is composed of hydroxy and epoxy fatty acids and is substantially imperm-eable to water and only the plant pathogenic bacteria are capable of degrading it. Initially, in order to identify the extent of cutin in cucumber (Cucumis sativus' C. sativus'), golden apples (Golden Delicious apple 'Malus domestica'), red ap-ples (Red Delicious apple 'Malus domestica'') and tomatoes (Solanum lycopersicum Mill. Commun ' S. lycopersicum'), their fruits were obtained. Cutin was extracted from the fruit skin of each studied specimen and compared by chloro-form-methanol method. Then, isolation of enzyme-producing strains was performed by the use of the specific medium containing cutin and enzyme activity assay. DNA of the specimens was extracted, and PCR were performed with univ-ersal primers for 16s DNA. The remainder was devoted to bioinformatic analysis, identification and registration of samples in the gene bank. The results showed that the percentage of extracted cutin in red apple was more than other samples and as a result, red apple are expected to be more resistant against diseases and pests. Also, six cutinase-prod-ucer strains of Klebsiella and Enterobacter were isolated with the help of enzyme activity and special culture medium containing cutin, and their 16s DNA region coding sequences were recorded in the GenBank.

کلیدواژه‌ها English

cutin
activity assay
bioinformatics
PNPB
16s DNA
Calado, C.R., Monteiro, S.M., Cabral, J.M. and Fonseca, L.P. 2002. Effect of pre-fermentation on the production of cutinase by a recombinant Saccharomyces cerevisiae. – J. Biosci. Bioeng. 93: 354-359.
Carvalho, C.M., Aires-Barros, M.R. and Cabral, J. 1998. Cutinase structure, function and biocatalytic applications. – Electron. J. Biotechnol. 1: 28-29.
Dantzig, A.H., Zuckerman, S.H. and Andonov-Roland, M.M. 1986. Isolation of a Fusarium solani mutant redu-ced in cutinase activity and virulence. – J. Bacteriol. 168: 911-916.
Fett, W., Gerard, H., Moreau, R., Osman, S. and Jones, L. 1992. Screening of nonfilamentous bacteria for prod-uction of cutin-degrading enzymes. – Appl. Environ. Microbiol. 58: 2123-2130.
Gerard, C.H., Fett, F.W., Osman, F.S. and Moreau, A.R. 1993. Evaluation of cutinase activity of various industrial lipases. – Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 181-189.
Heredia, A. 2003. Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer. Biochim. – Biophys. Acta. (BBA)-General Subjects 1620: 1-7.
Kolattukudy, P., Purdy, R. and Maiti, I. 1981. Cutinases from fungi and pollen. – Methods Enzymol. 71: 652-664.
Kolattukudy, P.E. 2005. Cutin from plants. – Biopolymers Online. doi: 10.1002/3527600035.bpol3a01
Leja, K. and Lewandowicz, G. 2010. Polymer biodegradation and biodegradable polymers- a review. – Polish J. Environ. Stud. 19: 255-266.
LIN, T.S. and Kolattukudy, P. 1980. Structural studies on cutinase, a glycoprotein containing novel amino acids and glucuronic acid amide at the N terminus. – Eur. J. Biochem. 106: 341-351.
Liu, Z., Gosser, Y., Baker, P.J., Ravee, Y., Lu, Z., Alemu, G., Li, H., Butterfoss, G.L., Kong, X.-P. and Gross, R. 2009. Structural and functional studies of Aspergillus oryzae cutinase: enhanced thermostability and hydrolytic activity of synthetic ester and polyester degradation. – J. Am. Chem. Soc. 131: 15711-15716.
Lopes, D.B., Fraga, L.P., Fleuri, L.F. and Macedo, G.A. 2011. Lipase and esterase: to what extent can this classification be applied accurately? – Food Sci. Tech-nol. (Campinas) 31: 603-613.
Macedo, G.A. and Pio, T.F. 2005. A rapid screening meth-od for cutinase producing microorganisms. – Braz. J. Microbiol. 36: 388-394.
Martin, J.T. and Juniper, B.E. 1970. The Cuticles of Plan-ts. – Hodder & Stoughton Educational. 347 pp.
Murphy, C.A., Cameron, J., Huang, S.J. and Vinopal, R.T. 1996. Fusarium polycaprolactone depolymerase is cuti-nase. – Appl. Environ. Microbiol. 62: 456-460.
Saladié, M., Matas, A.J., Isaacson, T., Jenks, M.A., Goodwin, S.M., Niklas, K.J., Xiaolin, R., Labavitch, J.M., Shackel, K.A. and Fernie, A.R. 2007. A reevalua-tion of the key factors that influence tomato fruit soft-ening and integrity. – Plant Physiol. 144: 1012-1028.
Shah, S., Sharma, S. and Gupta, M. 2003. Enzymatic transesterification for biodiesel production. – Indian J. Bioph. 40: 392-399.
Trail, F. and Köller, W. 1993. Diversity of cutinases from plant pathogenic fungi: purification and characterization of two cutinases from Alternaria brassicicola. – Physiol. Mol. Plant Pathol. 42: 205-220.

  • تاریخ دریافت 18 خرداد 1405
  • تاریخ انتشار 18 خرداد 1405